Staphylococcus aureus es un coco Gram positivo aerobio o anaerobio facultativo que produce fermentación láctica y es catalasa y coagulasa positivo. Posee numerosos factores de virulencia, en su mayoría componentes de la pared celular, y una variedad de exoproteínas que facilitan la colonización de nuevos hábitats. Estas propiedades, hacen que los estafilococos sean la causa de numerosas infecciones en mamíferos, que van desde afecciones superficiales de la piel a patologías severas como neumonías, meningitis, intoxicaciones alimentarias, shock séptico y desórdenes autoinmunes. De gran preocupación, es el hecho de que S. aureus sea un agente de infecciones nosocomiales fulminantes.
Las bacterias del género Staphylococcus son microorganismos ubicuos difíciles de eliminar que colonizan ambientes muy dispares formando parte de la microbiota habitual de la piel, la garganta y las fosas nasales de sus hospedadores vertebrados. Es una bacteria muy común en el medio ambiente, presente en las industrias alimentarias en suelos, agua y aire, utensilios y superficies, pudiendo vivir en humanos y animales. La mayoría de las cepas de estafilococos son productoras de enzimas (nucleasas, proteasas, lipasas, hialuronidasas y colagenazas) y citotoxinas (las denominadas hemolisinas a, ß, d y ?) que contribuyen a transformar los tejidos del hospedador en substrato para su crecimiento y desarrollo.
Producción y Peligrosidad de las Enterotoxinas Estafilocócicas
Algunas especies de estafilococos son productoras de una familia de proteínas no glicosiladas de bajo peso molecular (Mr 22-31.000) conocidas como enterotoxinas estafilocócicas (SEs). S. aureus produce alrededor de 11 serotipos distintos de SEs, además de otras toxinas de gran virulencia para los mamíferos denominadas toxina del síndrome del shock tóxico-1 (TSST-1) y toxinas exfoliativas ETA y ETB. Estas enterotoxinas son causa de intoxicaciones alimentarias por la ingesta de productos contaminados de origen cárnico y lácteo. La patología de la intoxicación cursa inicialmente con síntomas similares a la gripe, fiebre alta, eritema dérmico, hipotensión, nauseas, vómitos frecuentes y diarrea, pudiendo llegar a desencadenar un shock tóxico orgánico el cual, en un 5% de los casos, es causa de defunción.
Las SEs y la TSST-1 reciben la denominación de superantígenos por su capacidad para activar policlonalmente a los lifocitos T de mamíferos. El Staphylococcus Aureus es una bacteria muy habitual y presente en casi la mitad de la población mundial. Es una de las fuentes más habituales de contaminación alimentaria y, por lo tanto, un punto al que el manipulador de alimentos debe prestar una especial atención. Siguiendo unas pautas adecuadas, este microorganismo patógeno no debe representar un riesgo para los consumidores.
El staphylococcus aureus es una bacteria ubicua, considerada parte de la microbiota normal del ser humano, que se localiza en la piel de las personas sanas. La aparición de actividad patológica de esta bacteria se manifiesta en con una variada muestra de enfermedades, desde leves como infecciones cutáneas a graves como osteomielitis, meningitis, endocarditis o neumonía. Afecta al sistema gastrointestinal, tanto por infección directa del estafilococo como de la toxina estafilocócica que este produce.
Las enterotoxinas generadas por Staphylococcus son cadenas simples de proteínas con peso molecular de 26.000 a 29.000 daltons. Son resistentes a enzimas proteolíticos, como la tripsina y pepsina, lo cual le permite entrar de manera intacta en el tracto digestivo humano. La dosis infectiva es de menos de 1 microgramo, producido cuando la concentración de la bacteria en el alimento excede de 100.000 organismos por gramo de alimento analizado. Este nivel es indicativo de malas condiciones sanitarias durante los procesos de elaboración del alimento.
Factores de Virulencia y Resistencia
S. aureus produce varios factores de virulencia, que incluyen enterotoxinas (SE), la toxina exfoliativa (ET), la toxina del síndrome de choque tóxico (TSST-1), la termonucleasa, hialuronidasa, hemolisinas, lipasas y coagulasa. Las enterotoxinas estafilocócicas (SE) se han clasificado en cinco tipos serológicos clásicos (SEA, SEB, SEC, SED y SEE). Se ha informado que estas SE clásicas son responsables del 95% de brotes de envenenamiento por estafilococos. Entre las enterotoxinas, la SEA es la causa más común de intoxicación alimentaria relacionada con estafilococos en todo el mundo, seguido de SED y SEB. Varias SE se designan como toxinas similares a las toxinas SE (SEl) porque carecen de propiedades eméticas o éstas aún no se han probado. Por lo tanto, hasta la fecha, se han reportado un total de 21 toxinas SE y toxinas SEl.
La distribución de genes que codifican enterotoxinas en las cepas de S. aureus son muy variables, con algunas regiones estables del cromosoma (por ejemplo, grupo de genes enterotoxigénicos-EGC) asociado con linajes particulares, y otros llevados a elementos genéticos móviles. Los elementos genéticos móviles son segmentos de ADN que codifican enzimas y otras proteínas que confieren su capacidad para moverse horizontalmente entre las células bacterianas. En S. aureus, los principales elementos genéticos móviles son bacteriófagos, islas de patogenicidad de S. aureus (SaPI), plásmidos, transposones y cromosomas de cassettes estafilocócicos (SCC). Se ha informado que todos ellos portan genes SE, excepto los SCC que generalmente portan genes de resistencia a antibióticos. La mayoría de los elementos genéticos móviles pueden moverse a alta frecuencia entre aislamientos de S.
Desde su descubrimiento hasta hoy, las principales cepas de este microorganismo se han vuelto resistentes a antibióticos como la penicilina y el tratamiento frente a las infecciones producidas por este estafilococo se realiza con meticilina, un antibiótico semisintetico. Muchas de las enfernedades alimentarias tienen su origen en el staphylococcus aureus y la contaminación tiene su origen en la manipulación de los alimentos. Esta bacteria, y su enterotoxina, pueden localizarse en cualquier alimento. Produce intoxicaciones muy agudas en un corto periodo de tiempo, entre 2 y 12 horas.
Controlar las infecciones por S.aureus no es tarea fácil debido a su patogénesis multifactorial y a la constante aparición de cepas resistentes a los antibióticos, en particular a meticilina y vancomicina. Por otra parte, en la infección por S. aureus el sistema inmunitario del hospedador esta deprimido por las alteraciones que los superantígenos causan al sistema inmunitario. En la actualidad, se sabe que algunos antígenos de esta bacteria como el polisacárido capsular y las proteínas que unen colágeno y fibrinógeno inducen potentes respuestas inmunes al ser inoculadas en un contexto antigénico diferente al bacteriano. Con este fin, se realizan ensayos vacunales de fase III con inmunógenos conjugados de los serotipos 5 y 8 del polisacárido capsular y el toxoide de la exotoxina A de P. aeruginosa (Staph VAX). Otra vía prometedora la constituye la sueroterapia basada en antisueros policlonales y en anticuerpos monoclonales humanizados dirigidos a dianas bacterianas como el factor aglutinante (ClfA) para inhibir su adherencia a las células del hospedador.
S. aureus, mecanismos de resistencia
Métodos de Purificación de Enterotoxina A
La purificación de enterotoxinas de S. aureus es crucial para su estudio y para el desarrollo de métodos de detección y neutralización. En la investigación para determinar el método más eficiente y rápido para la purificación de la enterotoxina A (SEA) de Staphylococcus aureus M 7/1, se aplicaron y compararon diversos métodos. Estos incluyeron cromatografía de intercambio iónico en Amberlite y CM-celulosa, filtración en gel en Sephadex G-50, 75, 100 y Sephacryl, y cromatografía líquida de alta resolución en proteína (FPLC). Los criterios de comparación fueron la pureza obtenida y la velocidad del proceso.
La cromatografía de intercambio iónico en resina Amberlite demostró ser un método conveniente y rápido para eliminar otros componentes del medio de cultivo de la enterotoxina. Sin embargo, la pureza lograda con este método fue inferior al 70%. En contraste, la columna de intercambio iónico carboximetil (CM-celulosa) ofreció una pureza superior a la del método con Amberlite, con rendimientos de aproximadamente el 70% y 75%, respectivamente.
La aplicación de métodos de filtración en gel sobre Sephadex G-50, 75, 100 y Sephacryl resultó en una pureza de alrededor del 90%. Estos métodos, aunque efectivos para aumentar la pureza, pueden ser más lentos en comparación con otras técnicas.
La cromatografía líquida de alta resolución en proteína (FPLC) se destacó como el método más eficiente en términos de pureza (97%) y velocidad. Esta técnica permite una separación rápida y de alta resolución, lo que la convierte en la opción preferida para la obtención de enterotoxina A altamente purificada.
Desafíos en la Detección y Control
Dadas las actuales dificultades para controlar las infecciones por S. aureus, cobran importancia las medidas preventivas encaminadas a la detección de este patógeno en alimentos e instalaciones nosocomiales. Algunas de las técnicas existentes resultan poco sensibles (inmunodifusión, aglutinación) y otras costosas (PCR). En un intento de aportar métodos alternativos de detección de las enterotoxinas estafilocócicas, se han desarrollado inmunoensayos de captura basados en anticuerpos monoclonales que permiten detectar y cuantificar en poco tiempo nanogramos de la enterotoxina estafilocócica B (SEB) y la toxina TSST-1.
La detección de enterotoxinas de Staphylococcus aureus en un alimento (mediante inmunodifusión en gen, ELISA, ELFA…) requiere de complejidad instrumental, con subsecuente elevado coste, y el desarrollo metodológico inherente, con dificultades operativas. Por otra parte, la investigación de enterotoxinas de S.aureus en una cepa pura tiene un grado de dificultad considerable, aunque variable. El empleo de técnicas de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ha permitido superar estas dificultades, siendo una herramienta eficaz, sencilla, fiable, rápida y de bajo costo para establecer la presencia de genes de enterotoxinas en cepas de S. aureus. Se realizan PCR múltiple para detectar simultáneamente los genes más conocidos de enterotoxinas de Staphylococcus aureus (los genes productores de las enterotoxinas SEA a SElF), simultáneamente, en cepas aisladas de alimentos vinculados a brotes de intoxicación alimentaria.
El Staphylococcus Aureus es una bacteria extremadamente resistente, pero sensible a las temperaturas. La contaminación de un alimento en grado tóxico se produce tras la llegada del microorganismo al alimento y la inadecuada manipulación posterior de este. El uso de guantes y mascarilla se hace imprescindible para evitar la contaminación por parte del manipulador de alimentos portador de la bacteria. Se debe mantener la cadena de frío, ya que a baja temperatura el estafilococo se inactiva y no produce la toxina. Esto es sumamente importante ya que la enterotoxina es termoestable y una vez producida no se elimina con el cocinado.
Biofilms y su Rol en la Persistencia Bacteriana
Considerando un biofilm como una matriz biológicamente activa formada por células de una o varias especies y sustancias extracelulares en asociación con una superficie sólida, hemos de tener en cuenta que cuando se den las condiciones idóneas, liberará fragmentos que podrán aparecer de forma esporádica en el alimento. La matriz de estos biofilms protege a los microorganismos contra agentes antimicrobianos, previenen el acceso de biocidas, secuestrantes metálicos, toxinas, evitan la deshidratación, reforzando la resistencia de la biopelícula al estrés ambiental, permitiendo a los microorganismos capturar los nutrientes. Los nutrientes, el agua limitante, el diseño de equipos y el control de temperatura son aspectos importantes en el control del biofilm, siendo variables difíciles de cambiar, por lo que el control del biofilm queda reducido a la efectividad de la limpieza y desinfección que se realice sobre las áreas y equipos de proceso.
La limpieza está acompañada por el uso de productos químicos y la combinación de efectos físicos y químicos. En la mayoría de las plantas de procesado de alimentos, las superficies de contacto con los alimentos son limpiadas y desinfectadas diariamente, sin embargo muchas otras superficies como los tanques de almacenamiento y los exteriores de las bombas, paredes y techos no presentan un plan de limpieza efectivo. Estos aspectos generan una oportunidad para la formación de biofilms en presencia de humedad. Por otra parte, la formación de aerosoles es una de las principales fuentes de dispersión de los microorganismos. Estos son formados durante el lavado de las superficies y drenajes, o cuando los biofilms se secan y liberan material particulado. Se demostró que patógenos como el S. aureus sigue siendo viable en la superficie de acero, aún estando seca, después de procesos de L+D. La idea de secar rápidamente las superficies de acero inoxidable, después del proceso de limpieza y desinfección, podría disminuir la proliferación de las bacterias, ya que el agua es un factor que potencia el crecimiento microbiano y la formación de biofilms.
Consideraciones sobre Higiene y Desinfección
¿Por qué la importancia del conocimiento de los procesos de higiene por parte de especialistas? ¿Por qué discutir el uso de alcalino clorados como desinfectante general? ¿Qué efectos tiene las concentraciones subletales de principios activos biocidas? ¿Cómo es posible si no tengo resultados positivos de Staphylococcus aureus en superficies que sigan dando resultados positivos de enterotoxinas producidas por ellos? ¿Cómo, dónde y por qué se forman biofilms de Staphylococcus y qué hacemos para asegurarnos de su eliminación? ¿Cómo actúan los biocidas sobre la estructura de esta bacteria y a qué dosis las destruimos? Todas estas preguntas han de tener respuestas a la hora de plantear la elaboración de un programa de L+D en una industria alimentaria ante un problema puntual, teniendo en cuenta que el programa general de higiene establecido con sus procedimientos operativos ha de ser compatible y adaptable ante apariciones esporádicas de resultados no acordes con los estándares analíticos establecidos.
Procesos de producción, entradas y salidas de materiales auxiliares, materias primas, corrientes de aire, flujos de personal, maquinaria, necesariamente van en detrimento de la “esterilidad” de las instalaciones. Las industrias de alimentos son ecosistemas vivos, las luchas internas por la supervivencia de todos los seres vivos que constituyen la biocenosis de la industria, adaptaciones, mutaciones, resistencias, biofilms, quórum sensing, autoinductores, se manifiestan en el día a día, por lo que hemos de ser conscientes que el cero absoluto es imposible y además sería contraproducente. Los microorganismos en general, y las bacterias en particular, llevan millones de años en la Tierra, se han adaptado y han sido capaces de resistir a procesos evolutivos increíbles, por lo que, si unimos estos dos factores, hemos de ser conscientes de la importancia de hacer muy bien lo poco que podemos hacer. La toxina de Staphylococcus en un alimento, en una empresa que cumple sus procedimientos de limpieza y desinfección de forma adecuada según su proveedor de servicios de higiene, es un claro indicador de mal servicio.
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